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倒置熒光顯微鏡如何觀(guān)察光轉化熒光蛋白

時(shí)間:2024年06月13日

倒置熒光顯微鏡如何觀(guān)察光轉化熒光蛋白|應用百科

倒置熒光顯微鏡搭配熒光蛋白能可視化觀(guān)察活細胞的細胞器,而想達到更精細的特定目標細胞或特定部分進(jìn)行標記示蹤,則需要用到光激活、光轉化或光控開(kāi)關(guān)熒光蛋白,一般這需要共聚焦顯微鏡或者超分辨顯微鏡,但也有方法可以用普通的倒置熒光顯微鏡(寬場(chǎng)熒光)觀(guān)察,今天我們就來(lái)跟大家介紹一下。

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光轉化熒光蛋白mEos2轉化觀(guān)察

·光轉化熒光蛋白

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光轉化熒光蛋白Kaede有兩個(gè)激發(fā)峰,兩個(gè)發(fā)射峰

光轉化熒光蛋白是超分辨成像常用的染料,以Kaede為例,在激發(fā)光照射下,會(huì )發(fā)出綠色熒光,而用紫外照射后,會(huì )不可逆地轉化為紅色熒光。這種特性可以讓研究人員界定特定的細胞,或細胞的特定部分,作為ROI。

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光轉化熒光蛋白多來(lái)自珊瑚

這種綠紅轉化的熒光蛋白來(lái)自珊瑚,因其轉化跟秋天的楓葉從綠變紅相似,故而得名Kaede(楓葉),但由于性質(zhì)限制,Kaede并不是可靠易用的商用活細胞染色劑。在超分辨成像中常用的光轉化熒光蛋白主要有Dendra2、mEos2、和mKikGR三種。

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Dendra2熒光光譜更符合常規激發(fā)塊設計

·為什么用寬場(chǎng)熒光顯微鏡?

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研究級倒置熒光顯微鏡MF53-N(寬場(chǎng)熒光)

一般的熒光顯微鏡都是寬場(chǎng)熒光顯微鏡,相比共聚焦顯微鏡,它的Z軸分辨率沒(méi)有那么高,高倍放大下成像會(huì )有焦外激發(fā)形成的光暈,無(wú)法獲得邊緣非常銳利的熒光成像。

熒光顯微鏡觀(guān)察光轉化熒光蛋白有幾個(gè)好處,首先熒光顯微鏡的儀器成本要比共聚焦低得多,而且相對簡(jiǎn)便易用,是相對更普及的儀器設備。

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長(cháng)通U激發(fā)下的蕨葉,可見(jiàn)多色熒光

此外,共聚焦顯微鏡為了追求精度,通常無(wú)法在操作光轉化的同時(shí)觀(guān)察轉化情況。而熒光顯微鏡的U紫外激發(fā)塊配置,很多用的是LP長(cháng)通發(fā)射濾光片,可以同時(shí)顯示藍色發(fā)射到紅色發(fā)射,可以在操作光轉化同時(shí)觀(guān)察轉化情況。

·熒光顯微鏡如何觀(guān)察光轉化熒光蛋白

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研究級熒光顯微鏡MF43-N

熒光顯微鏡想要觀(guān)察光轉化熒光蛋白,先決條件是有多色激發(fā)塊配置,并且熒光光路有視場(chǎng)光闌,用長(cháng)通配置的U激發(fā)塊(DAPI激發(fā)塊),這可能需要研究級的熒光顯微鏡。

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Connexin43-Dendra2揭示縫隙連接蛋白Cx動(dòng)態(tài)

轉化前的成像和準備:

1、關(guān)燈準備暗室成像,讓眼睛適應暗室。

2、切換激發(fā)塊到藍色激發(fā)波長(cháng)。

3、LED熒光光源把亮度調低,然后關(guān)掉;汞燈光源請插入ND濾光鏡。關(guān)閉激發(fā)光擋板(如有)。

4、轉換為100X油浸物鏡或其他高倍物鏡,油鏡加油。

5、放置準備好的樣品。

6、使用相襯觀(guān)察,對焦到細胞上,把轉化目標移到視野中間。

7、LED熒光光源打開(kāi)激發(fā)光;汞燈光源打開(kāi)激發(fā)光擋板(如有);

8、調節到合適參數,拍照,獲得轉化處理前綠色熒光圖像。

9、切換激發(fā)塊到綠色激發(fā)波長(cháng),調節參數拍攝紅色熒光圖像。通常沒(méi)有或少量紅色熒光。

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Dendra2-H2B揭示組蛋白H2B非常穩定

操作觀(guān)察轉化熒光蛋白和成像:

1、相襯觀(guān)察,確認目標在視野中間。

2、收小熒光光路的視場(chǎng)光闌,以將熒光照射范圍縮小到視野中間。

3、切換激發(fā)塊到紫外波長(cháng),調高LED熒光光源亮度,汞燈要拔出ND減光鏡??梢栽谀跨R下看到綠色熒光向紅色熒光轉化,可以調節熒光光路的視場(chǎng)光闌控制轉化區域大小,轉化時(shí)間可能耗時(shí)5-10秒,視乎紫外光源的強度。

4、切換到B激發(fā)塊,打開(kāi)熒光光路視場(chǎng)光闌,拍攝綠色熒光,切換到G激發(fā)塊拍攝紅色熒光,現在應該可以看到明顯的紅色熒光。

5、設定時(shí)間間隔,拍攝綠色和紅色熒光,即可對特定細胞或者蛋白的變化進(jìn)行研究了。

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Dendra2-α-tubulin示蹤微管蛋白動(dòng)態(tài)聚合和分離

利用這套工作流,你還可以觀(guān)察光激活蛋白、FRET熒光共振能量轉移、光控開(kāi)關(guān)熒光蛋白,對于一些比較宏觀(guān)的教學(xué)和研究都非常方便。

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