一、熒光基礎知識
在顯微成像中,熒光指的是一種光致發(fā)光現象,某些分子能吸收特定波長(cháng)的光線(xiàn),然后再發(fā)射出其他波長(cháng)的光線(xiàn)的物理現象,這種分子一般稱(chēng)為熒光團。通常情況下,由于斯托克斯位移,熒光團的激發(fā)峰值和發(fā)射光譜之間存在差值,發(fā)射光線(xiàn)能量低于吸收光線(xiàn),波長(cháng)比激發(fā)
熒光現象有兩種:自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光。自發(fā)熒光也稱(chēng)固有熒光,是指經(jīng)照射后就能發(fā)出熒光;繼發(fā)熒光也稱(chēng)二次熒光,物質(zhì)經(jīng)照射后不能或只能部分發(fā)生微弱熒光,需先用熒光染料標記處理,再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。目前在熒光顯微技術(shù)中,主要利用的是繼發(fā)熒光現象。
念珠藻葉綠體的自發(fā)熒光,明美MF52-N拍攝
熒光產(chǎn)生包含激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)過(guò)程,在熒光顯微技術(shù)中具體體現為以下幾個(gè)關(guān)鍵部件:
(1)激發(fā)光源:主要包含以下兩個(gè)指標
? 光源光譜覆蓋發(fā)射光譜:熒光團在特定波段范圍才能被大部分激發(fā),因此激發(fā)光源的光譜范圍要能匹配所觀(guān)察樣本中的熒光團激發(fā)特征。
? 發(fā)射光譜波段的強度:熒光信號一般較弱,需要使用較高亮度的激發(fā)光以產(chǎn)生較強信號的發(fā)射熒光信號。
(明美四通道LED光源MG120,寬光譜+高光功)
(2)激發(fā)塊:用于形成特異性激發(fā)發(fā)射的一組濾光片,一般包含以下三個(gè)
? 激發(fā)濾光片EX:濾過(guò)光源中特定波段的光,用以激發(fā)樣本中特定染料
? 發(fā)射濾光片EM:允許熒光團發(fā)射的特定波段的光通過(guò)
? 二向分色鏡DM:反射激發(fā)波段的光,透過(guò)發(fā)射波段的光。透射熒光顯微鏡沒(méi)有這個(gè)濾光片,但目前主流都是落射熒光顯微鏡,會(huì )有二向
(明美可定制適配四大品牌,不同波段需求的激發(fā)塊)
二、熒光顯微成像的應用
熒光顯微鏡利用自發(fā)熒光或繼發(fā)熒光現象,廣泛用于生物(醫學(xué))、礦物、材料科學(xué)等領(lǐng)域的顯微熒光觀(guān)測。①在生物學(xué)領(lǐng)域,主要借助熒光染料標記,可準確和詳細地識別細胞和亞微觀(guān)細胞成分。②在礦物學(xué)領(lǐng)域,通常用于研究有自發(fā)熒光特性的物質(zhì),如石油、煤炭、氧化石墨烯等礦物。③在材料科學(xué),可用于紡織工業(yè)或造紙業(yè)來(lái)分析基于纖維的材料,包括紡織品和紙張,在半導體領(lǐng)域,也可用來(lái)觀(guān)測具有熒光特性的材料如磁珠等。
明美MF31-LED熒光顯微鏡觀(guān)察SBS改性瀝青
(MF43-N拍攝的磁珠熒光圖片)
熒光顯微技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域中應用是廣泛也是復雜的,主要是對細菌、細胞、組織或小型生物(如斑馬魚(yú)等模式生物)進(jìn)行標記成像,它的微觀(guān)層面都是通過(guò)熒光染料對分子層面進(jìn)行標記。從熒光染料的選擇看,通常需要考慮幾個(gè)因素,一是熒光染料標記的位置,二是該染料對應的激發(fā)特征,包括吸收光譜特征和發(fā)射光譜特征。借助熒光染料,熒光顯微技術(shù)不只局限于蛋白質(zhì),它還可以對核酸、聚糖進(jìn)行染色,甚至鈣離子等非生物物質(zhì)也可以檢測。以下根據染料結合的位置列舉了一些常見(jiàn)的熒光染料及應用范圍:
FITC熒光染色,MF52-N拍攝
(1)免疫熒光(IF):主要標記的是蛋白質(zhì)。免疫熒光技術(shù)利用抗體可以和相應抗原特異性結合的特性,主要有兩種方式:一是利用內源熒光信號,即通過(guò)克隆技術(shù)用遺傳學(xué)方法將熒光蛋白與目的蛋白GFP等;二是利用熒光標記的抗體與目的蛋白特異性結合。
? FITC(異硫氰酸熒光素):是一種有機熒光染料,495/517 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值,可以和蛋白質(zhì)上的基團結合,主要用于免疫熒光和流式細胞術(shù)中。
? TRITC(四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸):屬于羅丹明家族的衍生物,550/573 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值,可與蛋白質(zhì)結合。
? 花箐染料(cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列):非特異性吸附少,消光系數高,熒光量子產(chǎn)率高,從而讓標記顯影時(shí)背景弱,信號強。除細胞顯影外,它們也常用于生物篩選、蛋白免疫印跡、生物醫學(xué)顯影、小動(dòng)物體內成像等。
? Alexa Fluor系列:屬于帶負電荷且親水的熒光染料系列,是不同基礎熒光物質(zhì)的磺化形式。這些產(chǎn)品標識涵蓋了對應的激發(fā)波長(cháng),相比于FITC等染料,具有更好的穩定性和熒光亮度。
DAPI熒光染色,MF52-N拍攝
(2)DNA染色:主要標記核酸。同蛋白質(zhì)一樣,對核酸進(jìn)行標記與研究同樣有重要意義,如對細胞核(主要成分為核酸)進(jìn)行染色標記可以判斷細胞的數量和位置。
? DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚):當DAPI與雙股DNA結合時(shí),在358nm處有一個(gè)吸收峰值,在461nm處有一個(gè)發(fā)射峰值,其發(fā)射光的波長(cháng)范圍含蓋了藍色至青綠色。DAPI也可與RNA結合,但產(chǎn)生的熒光強度不及與DNA結合的結果。DAPI可以透過(guò)完整的細胞膜,因此被廣泛用于活細胞和固定細胞的染色。
? Hoechst(33258、33342、34580):這三種染料都可在350nm左右的紫外光激發(fā),在461nm處發(fā)出藍靛色熒光。與DAPI類(lèi)似,Hoechst可透過(guò)完整細胞膜,被廣泛用于活細胞和固定細胞染色。
? PI(碘化丙啶):是一種不能透過(guò)細胞膜的DNA染色劑。與核酸結合后,激發(fā)波長(cháng)為538 nm,發(fā)射波長(cháng)為617 nm。由于該染色劑無(wú)法進(jìn)入完整的細胞中,因此該染色劑常用于區分細胞群中的活細胞和死細胞。
Fura2鈣離子探針做的研究圖片,引自公開(kāi)文獻
Front. Neural Circuits11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011
(3)離子成像:研究細胞中各種離子的流動(dòng)與分布對細胞活動(dòng)的深入理解有重要作用。通過(guò)各種離子指示劑,如鈣離子、鈉離子、鎂離子、鋅離子等指示劑與離子結合形成熒光團,利用光譜特征檢測對應離子的分布狀態(tài)。
三、熒光顯微成像的挑戰
應用熒光顯微技術(shù)進(jìn)行成像的過(guò)程中,不僅要考慮成像的質(zhì)量,包括分辨率、對比度、熒光信號強弱、背景光、多通道成像等,還要考慮熒光染料、光照等對樣本的影響,比如熒光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了熒光顯微技術(shù)應用中的常見(jiàn)挑戰與應對方法:
汞燈需搭配帶計時(shí)器的復雜控制箱來(lái)使用
(1)激發(fā)光源選擇和使用。傳統熒光成像使用的是高壓汞燈,具有特異性的光譜特征和較高的光強,但使用有很多麻煩,首先需要預熱,然后光強靠ND濾鏡調節,壽命較短可能就200小時(shí),在壽命用完前還會(huì )有光強衰減問(wèn)題,需要調整ND濾鏡,替換燈泡后需要重新校中。目前很多應用都用LED熒光光源取代汞燈作為熒光光源,如寬光譜大功率LED熒光光源MG-100,壽命長(cháng)單個(gè)可以頂50個(gè)汞燈,光強更穩定可控,并且可以即開(kāi)即用,省事省心。
明美可定制適配四大品牌的濾光片組
(2)濾光片質(zhì)量和匹配度。激發(fā)塊中的濾光片質(zhì)量會(huì )影響激發(fā)光和發(fā)射光的透過(guò)率,影響熒光效率并帶來(lái)雜散光和背景噪聲問(wèn)題。同時(shí),濾光片的參數能否匹配染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰,也會(huì )對熒光效果產(chǎn)生重大影響。對于簡(jiǎn)易熒光需求,明美建議使用數顯熒光模塊,整合光源和等常用激發(fā)塊,可以為四大品牌顯微鏡升級熒光觀(guān)察,簡(jiǎn)單易用效果好。對于專(zhuān)業(yè)熒光需求,明美提供匹配四大品牌主流熒光顯微鏡的激發(fā)盒和濾光片組,可按需定制不同濾光片組合,Fura2探針需要用U激發(fā)G發(fā)射,發(fā)射濾光片組并不適合。
(MF43-N+MC50-S拍攝的小鼠腦片熒光圖像)
(3)光毒性與熒光染料毒性:在生物學(xué)領(lǐng)域的熒光成像中,需考慮光毒性與熒光染料毒性對樣本的影響,如細胞內的有機分子在與氧反應時(shí)吸收光發(fā)生分解并產(chǎn)生自由基,部分熒光染料本身也能產(chǎn)生自由基,這是引起細胞等生物樣本損傷的主要來(lái)源。通常的應對思路是:①使用具有較低能量(波長(cháng)較長(cháng))激發(fā)光譜的熒光染料;②盡可能低的光強和盡可能短的激發(fā)時(shí)間,需要在成像質(zhì)量與樣本健康之間保持平衡;③降低幀速率,尤其在長(cháng)時(shí)間的熒光成像中,這種情況需要提高相機的靈敏度,保證捕獲微弱的熒光信號。
(單通道熒光拍攝,經(jīng)軟件合成多色熒光圖像)
(4)多色熒光成像:在生物學(xué)領(lǐng)域應用較多,尤其是在對活細胞標記成像時(shí),需同時(shí)對多種物質(zhì)進(jìn)行標記,并在一個(gè)圖像中顯示,而大多數熒光染料具有寬發(fā)射光譜,在使用多種染料標記時(shí)會(huì )出現熒光光譜重疊現象。對于多色熒光成像,有兩種應對思路,一是針對每種染料使用對應的單通道窄帶濾光片,后通過(guò)軟件進(jìn)行合成,這種方式對成像速度及軟件圖像處理提出較高要求;二是使用寬光譜光源同時(shí)激發(fā),選用雙通濾光片或多通濾光片,這種濾光片的的特點(diǎn)是允許兩種或以上波段熒光信號通過(guò),可實(shí)現一組濾光片同時(shí)觀(guān)察兩種或以上熒光染料,這種方式要求相鄰的發(fā)射光譜范圍沒(méi)有重疊,所得到的熒光信號之間能較好的被區分。
(雙通濾光片熒光拍攝,鏡下可同時(shí)觀(guān)察到B\G兩種熒光信號)
四、明美熒光顯微成像解決方案
醫院真菌、婦科等常規熒光檢測
推薦:MF52-N/MF31+普通顯微鏡相機MSX1/MC50-S/MS60/MD50等
? 數顯LED熒光模塊,可定制的單色或三色激發(fā),推拉式切換,即開(kāi)即用
? 高數值孔徑熒光物鏡,高清晰度與高熒光透過(guò)率
? 可拍攝數字圖片,方便出具報告,可合成多色熒光圖像
(2)高校、研究所等科研研究,醫院癌癥復核等高要求檢測
推薦:MF53-N/MF43-N + MG100/MG120 + 高靈敏度相機MC50-S/MS23/MSH12
? 研究級熒光顯微鏡機身,具備更好的熒光效果和更強的擴展性能,應對各種需求
? 6孔轉盤(pán)式熒光附件,可按需自主選擇激發(fā)塊,實(shí)現對多種熒光染料觀(guān)測
? 可定制雙通等特殊濾光片組,實(shí)現效率更高的FISH等觀(guān)察應用需求
? LED激發(fā)光源,大功率寬光譜激發(fā)效果好,即開(kāi)即用使用便捷,壽命長(cháng)性?xún)r(jià)比高
? 高靈敏度相機,效率更高得實(shí)時(shí)反饋動(dòng)態(tài)圖像,搭配軟件可實(shí)現等應用
斑馬魚(yú)、果蠅、朱墨時(shí)序等宏觀(guān)熒光觀(guān)察
推薦:MZX81/MZX100 + 普通顯微鏡相機MSX1/MC50-S/MS60/MD50等
? 高質(zhì)量平場(chǎng)(復消色差物鏡,獨立平行雙光路,大變倍比,成像效果好
? 數顯熒光模塊,可選BG等雙色激發(fā),紫外單獨外置,減少對樣品和機內鍍膜損害
? 廣泛應用于斑馬魚(yú)、線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅、朱墨時(shí)序、新材料等領(lǐng)域,豐富經(jīng)驗
(4)四大品牌普通顯微鏡升級熒光觀(guān)察
推薦:數顯熒光模塊,或批量定制熒光模塊
? 可適配四大品牌大部分無(wú)限遠光學(xué)顯微鏡,高性?xún)r(jià)比升級熒光觀(guān)察
? 數顯屏幕,直觀(guān)顯示當前波段和亮度,方便定量分析
? 內置LED熒光光源,可選單色或BGU等三色激發(fā),可選電動(dòng)切換或四色激發(fā)
(5)四大品牌熒光顯微鏡升級LED熒光光源或定制熒光激發(fā)塊
推薦:寬光譜大功率熒光光源MG-120,四通道光源
? 可匹配四大品牌主流熒光顯微鏡,覆蓋可見(jiàn)光激發(fā)光譜,激發(fā)效果穩定
? 觸屏控制器,直觀(guān)易用的操作體驗,可加入人走燈滅等智能功能
? 壽命長(cháng),即開(kāi)即用,1個(gè)LED光源頂50個(gè)汞燈,無(wú)需預熱
? 光強調節高度線(xiàn)性,MG-120支持軟件觸發(fā)和TTL電平脈沖模式觸發(fā)
文章鏈接:https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2021/lc/d1lc00326g
相關(guān)文章閱讀推薦: