最近，研究者已經(jīng)可以在配有高數值孔徑物鏡的顯微鏡上搭配熒光觀(guān)察方法。隨著(zhù)生物特異性的熒光蛋白（如綠色熒光蛋白，GFP）的出現，熒光觀(guān)察也開(kāi)始出現在體視鏡上。

由于體視鏡的視野及工作距離大，通過(guò)體視鏡熒光照明，研究者可以分辨出表達熒光蛋白的生物，如線(xiàn)蟲(chóng)，斑馬魚(yú)，卵母細胞，成熟的昆蟲(chóng)等。同時(shí)，研究者們可使用鑷子，滴管或其他顯微操作設備處理樣品。另外，在體視鏡下，體視熒光照明更利于樣品的觀(guān)察記錄。

體視鏡的熒光照明器與復合式顯微上的相同。熒光照明器中有氙燈或汞燈作為光源，外罩一個(gè)燈室，燈室通過(guò)垂直照明器與顯微鏡機身相連。如Figure1,2，垂直照明器位于機身的變倍體與觀(guān)察筒之間。

下面我們以Nikon SMZ1500體視鏡為例，介紹下體視熒光的光路。

由光源發(fā)出的光經(jīng)過(guò)匯聚透鏡到達濾色塊組中的激發(fā)光濾光片，在這里，光源中的光只有一部分（某段特定的波長(cháng)）能夠通過(guò)濾片。透過(guò)濾片的光被半透半反鏡反射，經(jīng)過(guò)機身下部的變倍體透鏡組，物鏡，到達樣品。半透半反鏡的具有反射小于特定波長(cháng)的光，而使大于特定波長(cháng)的光透過(guò)的特性。

透過(guò)物鏡的光已倒錐形照射到樣品上，激發(fā)與之相應的熒光物質(zhì)。發(fā)射出的熒光透過(guò)物鏡，中間變倍體，到達發(fā)射光濾光片；在這里，又會(huì )有一部分光被濾掉，只有被激發(fā)出的熒光會(huì )通過(guò)發(fā)射光濾光片。Figure1,2 中顯示的為光路構想圖。左側的光路中，發(fā)射出的熒光直透過(guò)達發(fā)射光濾光片，然后進(jìn)入相機或目鏡觀(guān)察筒；右側的光路中的發(fā)射光要先透過(guò)過(guò)半透半反鏡，再透過(guò)發(fā)射光濾光片，最后進(jìn)入目鏡觀(guān)察筒。

Figure2,3為熒光濾色塊組示意圖。每個(gè)濾色塊組有一個(gè)半透半反鏡，一個(gè)激發(fā)光濾光片，兩個(gè)發(fā)射光濾光片。如前面介紹的，由光源發(fā)出的光透過(guò)激發(fā)光濾光片進(jìn)入濾色塊組，被半透半反鏡反射；發(fā)射出的熒光透過(guò)發(fā)射光濾光片進(jìn)入目鏡或相機。在這一組合中，半透半反鏡以及左側的發(fā)射光濾光片是固定在架子上的，而右側的發(fā)射光濾光片則安裝在一個(gè)可以拆卸的濾片框內。只要松動(dòng)螺絲，就可以拆下右側的濾片框，然后根據需要，更換半透半反鏡。更換時(shí)需要注意，不要把固定用的膠水，涂到半透半反鏡上，操作要帶手套，避免將指紋留在鏡面上。

上述體視鏡可搭配3各熒光濾色塊，以及一個(gè)用于明場(chǎng)觀(guān)察的無(wú)濾片塊。觀(guān)察時(shí)，可通過(guò)拉動(dòng)杠桿調節濾色塊的位置，每一個(gè)濾色塊配有不同的標識，便于選擇。

Table1中為Nikon提供的多種濾色片組合。這些濾色片涵蓋了熒光激發(fā)/發(fā)射的大部分波長(cháng)范圍（激發(fā)波段380nm-510nm的染料都適用），適用于生物學(xué)研究及工業(yè)研究。同時(shí)，下列組合也適用于綠色熒光蛋白變種的研究，如cyan及藍色熒光蛋白。在活細胞觀(guān)察中，選擇適當的濾色片組合會(huì )極大的提高信號的強度。另外，考慮到葉綠素的自發(fā)熒光，當選擇為植物觀(guān)察特別設計的濾片組。

體視鏡熒光濾片組合:

長(cháng)時(shí)間高強度光照及紫外線(xiàn)照射將會(huì )對濾色片造成損害，另外，環(huán)境的濕度也會(huì )對濾片的帶通造成影響。為了延長(cháng)濾片的使用壽命，應該將濾片儲存在干燥器中，或者放置在有干燥器的密封箱內。同時(shí)，應當減少濾片的曝光的時(shí)間，如不觀(guān)察的時(shí)候應該關(guān)閉光源的光閘，保護濾片。清潔濾片時(shí)應使用洗耳球，駝毛刷，或無(wú)油的氣體加壓器通過(guò)干燥的空氣進(jìn)行清潔。千萬(wàn)不可以使用擦鏡紙，它們會(huì )劃傷濾片上的鍍膜。

以Nikon SMZ1500為例，這款體視鏡的放大倍數為4x到540x，接近一臺復合式顯微鏡的放大倍數。研究者可以通過(guò)這樣的體視鏡觀(guān)察大體積的活樣品，或經(jīng)熒光標記的薄切片。Figure4為三色熒光染色的小鼠腎臟切片。使用的染料分別為DAPI, Alexa Fluor 488 WGA, 及 Alexa Fluor 568，相應的濾色片為T(mén)able1中的Blue GFP/DAPI, Endow GFP Bandpass, 及 TRITC DsRed。這張圖片體現了體視鏡具備了觀(guān)察復合式顯微鏡樣品的能力。

其他的顯微鏡制造商有著(zhù)不同的提示熒光照明設計，如Figure5中為比較主流的模式之一。在這一設計中，有一個(gè)獨立于成像光路的熒光照明通道。由光源發(fā)出的光首先經(jīng)過(guò)激發(fā)光濾色片，然后通過(guò)主機后方的通道到達底部的透鏡組，這些透鏡組將光傳導到樣品上。這樣的設計保證了無(wú)論在何種放大倍數下，激發(fā)光都會(huì )直接照射在樣品上，范圍，發(fā)射光強度，黑背景都不隨放大倍數改變。發(fā)射出的熒光通過(guò)物鏡到達變倍體最后透過(guò)發(fā)射光濾光片，進(jìn)入目鏡用于觀(guān)察或進(jìn)入相機。這一設計主要的優(yōu)勢在于取消了半透半反鏡，并且濾片的組合可變，研究者可選的范圍很大。然而，這也帶來(lái)了相應的問(wèn)題，如，沒(méi)有經(jīng)驗的操作者可能會(huì )因為選擇了錯誤濾片組合而觀(guān)察不到熒光。

由汞燈產(chǎn)生的強紫外線(xiàn)會(huì )損傷觀(guān)察者的視網(wǎng)膜。許多廠(chǎng)家為了避免這一事故都引用了保護設施濾掉照射在樣品及載物臺上的紫外線(xiàn)。同時(shí)還有很多其他的保護措施，如在光路中加入濾片。體視熒光鏡中通常在燈箱及垂直照明器之間裝有光閘，當不觀(guān)察樣品或不照相時(shí)，光閘將會(huì )關(guān)閉，以保護樣品不受長(cháng)時(shí)間紫外線(xiàn)的傷害。有時(shí)在高倍平場(chǎng)復消色差物鏡（1.6x至2.0x）配合低變倍比的情況下，視野里較低的部分可能會(huì )出現反射及hot spots現象。這一假象通常在調高變倍比時(shí)消失。而且在使用低放大倍數物鏡（0.5x或1.0x）以及高放大倍數低校正物鏡（消色差物鏡，平場(chǎng)消色差物鏡）時(shí)不會(huì )出現這一假象。使用體視鏡可以觀(guān)察很多種樣品，如Table2,從生物到工業(yè)制造。

體視鏡熒光的應用

與復合式顯微鏡相比，大工作距離及景深使體視熒光能夠提供全景信息并觀(guān)察高強度熒光。這些特性為研究者們帶來(lái)了很多便利，比如可以操作大的生物樣品，或者材料技術(shù)師可在此進(jìn)行包埋，檢查電子元件，或切割?，F在特殊用途的濾片組合越來(lái)越豐富，體視熒光鏡也將得到更好的發(fā)展。